细胞培养

　　细胞（cell）是生命的最基本单位，生物的一切活动都是通过细胞作用实现的。细胞的发现是19世纪三大发现之一。

一、细胞发现简史

　　1665年，英国物理学家罗伯特·虎克设计制造了一台结构复杂的显微镜，并用它来观察各种物体。他把一块软木的薄片做成切片，放在显微镜下观察，看到这块软木片是由很多小室构成，各个小室之间有壁隔开，形状很像蜂房。他把这样的小室结构称为“细胞”，从而使他成为第一个发现和提出“细胞”的人。其实，他观察的是空了的细胞的细胞壁，没有原生质，并非是真正的细胞。当时人们都把细胞壁看成是细胞的主要成分。1671年英国人格留比虎克更精确地观察了植物体的构造。他指出植物体的构造与纺织品一样，由经线和纬线交织一起成花纹状，他把构成花纹的这一个个的小格子叫小囊。意大利人马尔比基也用显微镜观察了植物切片，认为植物体是由排列很紧密的小囊所组成的。他们的观察都发现植物的幼嫩部分是液状的、被薄壁包围着的细胞，细胞里充满了粘稠的物质。

　　1840年,普尔金苛通过观察动物的胚物质，在动物细胞内发现有一种能够生长的物质，他将这种物质称为原生质，到了1846年·？摩尔在植物细胞里发现粘液状、含有颗粒的物质，他也把这种物质命名为原生质。原生质的概念就从此确定下来。这样，在对细胞的观察研究中，由对细胞壁的观察逐步转向了关心细胞内部结构的研究。1856年雷第提出了细胞的定义，他说细胞是含有一个细胞核的原生质小块。其定义的实质是：细胞必须有原生质；细胞里必须有细胞核。这种认识直到现在还被人们普遍地接受着。1868年，英国人赫胥黎提出原生质是生命的物质基础。1879年，德国施特拉斯布格认为，原生质是指动植物细胞内整个的粘稠的有颗粒的胶体物质，包括细胞质和核质。他把细胞中细胞核以外的物质命名为细胞质。1880年，德国汉斯坦将细胞质和核质合称为原生质体，并指出它的外面包着质膜。随着对细胞研究的深入和发展，人们以原生质泛指细胞内的全部生命物质，包括细胞膜、细胞质和细胞核，并逐渐揭示出它的主要成分是核酸和蛋白质。

　　二、细胞学说的建立

　　自虎克用自制的显微镜观察软木切片发现细胞的研究成果公开以后，17世纪末和18世纪初，又有很多学者在显微镜下研究血液和低等动物，发现血液和低等动物也是由细胞构成的。随着显微镜制造技术的提高，人们对细胞的研究愈来愈广泛深入，大量的研究事实说明生物是由细胞组成的。著名的博物学家拉马克1809年提出，物体若其组成部分不是细胞性组织，或不由细胞组织所形成者，不可能有生命。1838年，德国人施莱登对植物细胞进行了大量的研究工作后，发表了关于植物发生的论文，提出了细胞是构成植物体的基本单位的看法。德国人施旺对动物细胞进行了大量的研究，根据对鸡、青蛙，甚至哺乳类的卵黄量的比较等的观察研究，1839年他发表了《关于动植物在构造与生长上的一致性的显微研究》一文。施旺提出，细胞结构是一切动物体共有的结构特征，并进一步指出了动物和植物在结构上的统一性。他认为，不论是动物还是植物，都是由细胞构成的，细胞结构是生物体的共同特征。初步使用了细胞学说一语。这样，细胞学说在19世纪30年代就确立了。所谓细胞学说，即一切动物和植物都是由细胞构成的，细胞是生命的单位。既然细胞学说认为生物界动物和植物都是由细胞构成的，这就有力地证明了生物彼此之间存在着亲缘关系，这样细胞学说的建立就对生物进化理论的确立起了很大的作用，因而被恩格斯誉为19世纪自然科学的三大发现之一。

　　三、细胞结构和功能的初步发现

　　虎克1665年发现细胞以后，许多学者经过长期的研究过程，对细胞的结构逐渐有了一定的认识。人们发现细胞的内容主要不是细胞壁，活细胞内还存在着比细胞壁更重要的细胞核、细胞质及细胞质中的一些细胞器。1897年，本达在用他改良的固体染色法观察研究动物细胞时，清楚地看到了细胞内有一种颗粒状物质，给它命名为线粒体。线粒体一词是根据希腊语的mitos（纤维状的）和chondros（颗粒的）而产生的，意即线粒体像个细线头状的小颗粒。到了20世纪50年代开始应用超速离心分离技术，把细胞破碎后在超速离心机中进行分离，就能够收集到线粒体，再通过电镜观察发现线粒体由内外两层膜构成，内膜向内腔折叠形成嵴，嵴上有许多小球状的基粒。进一步通过对呼吸现象的研究，发现线粒体的内膜、基质和基粒中有许多与呼吸作用有关的酶，说明线粒体是细胞呼吸作用的主要场所，细胞活动所需要的能量大部分都是线粒体中合成的ATP提供的。

　　意大利学者高尔基研究出了一种观察神经细胞的方法，他用重铬酸钾、锇酸、硝酸银进行处理，让银的颗粒附着在神经细胞的表面，这样就能够很清楚地观察神经细胞。1898年，他以猫头鹰和猫为材料观察研究神经细胞，发现了细胞内有一种网状构造的细胞器，称为高尔基体或叫高尔基器。到电子显微镜应用后，对它的细微构造才有了深入的了解，看到高尔基体是由滑面型膜围成的扁平囊状和泡状结构组成的。1945年，罗特和柯劳德发现细胞质中有由膜围成的管状或扁平囊状的结构，互相连通成网状，把它命名为内质网。在后来的不断研究中，人们把膜外侧附着有核糖体的称粗面型内质网，否则称为滑面型内质网。粗面型内质网既是核糖体附着的支架，又是核糖体新合成的蛋白质的运输通道。滑面型内质网可能参与糖元和脂类、固醇类激素的合成，以及具有分泌作用等。在真核细胞的细胞质中，除了线粒体、内质网、高尔基体外，还普遍具有核糖体、溶酶体、微体等细胞器。此外，动物细胞中有中心体，植物细胞中还有叶绿体、圆球体、液泡等细胞器。

　　关于细胞膜结构的研究，早在1925年，德国的高特和戈来德尔用丙酮抽提红细胞膜的类脂，并将它在空气和水的界面上铺成单分子层时，发现这个单分子层的面积相当原来红细胞表面积的2倍，由此提出红细胞的细胞膜是由两层类脂分子组成的。1935年，丹尼尔利和戴维桑发现细胞的表面张力低于油-水界面张力的很多倍，所以细胞膜不可能是由单纯类脂分子构成的，提出在类脂双分子层内外都有蛋白质覆盖，这样就形成了细胞膜结构的蛋白质-磷脂-蛋白质的三合板式结构模型。在这种最早的模型基础上，1957年罗伯特桑提出单位膜模型，它的特点是认为细胞膜内外表面的蛋白质不是球状蛋白，而是薄片状的。1972年，辛戈和尼柯桑又提出了受到广泛支持的流动镶嵌模型，认为细胞膜的结构成分不是静止的，而是可以流动的，而且细胞膜中的蛋白质也是可以运动的。这样，细胞膜才成为选择透过性膜，具有内外物质输送的功能。
 
　　细胞的模型结构图

　　随着对细胞结构的深入研究，细胞内的微细结构也就被人们越来越清楚地认识了。现在认为，细胞是生命的形态和功能单位，一切生命现象都可以从细胞中找到解答。线粒体为细胞的动力工厂，内质网极其上附着的核糖体为蛋白质的翻译机器，高尔基体为细胞内物质加工，改造，运输和分泌的细胞器，细胞核为基因的所在地，它是指挥细胞生命活动的司令部，细胞膜是细胞与外界环境分隔开来的界膜，膜上的多种受体向细胞内传递各种信息，细胞骨架负责细胞形态的维持，运动及信号，物质传递与运输，多种蛋白，酶和细胞器的支持点。核基质负责核形态的维持，基因的复制，转录，细胞。细胞象一个全能的大工厂，精细的分隔，严密的组织，有序的代谢活动，使细胞成为工作效率极高的单位。

　　四、细胞培养技术

　　细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养，既包括微生物细胞的培养，也包括动物和植物细胞及动植物组织的培养。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。

　　细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂(如琼脂)或固体培养物(如麸皮、大米等)便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须首先解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。

　　1、细胞培养的一般条件

　　简言之，既细胞需要什么就提供什么，道理是如此，真正能做到这点尚需时日，人们至今对细胞的生命周期控制机理认识不足，癌细胞虽然也来自正常细胞，但至今不知道究竟为什么癌细胞很难停止已经启动的有害分裂，尽管如此，人们长期的研究结果表明，离体细胞培养需要的基本条件就是下列细胞生理条件。

　　(1)温度

　　温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。多数生物大分子遇到高温后容易导致空间结构改变或者丧失（变性）。细胞膜遇到高温后容易变态。在自然界，即有耐高温的细胞，也有耐低温的细胞。在极端情况下生长的生物对付极端环境的机制研究在生物进化和农业、环保、发酵工业中意义重大。

　　(2)pH

　　过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。

　　(3)渗透压

　　细胞内外可溶于水的物质比例和种类决定细胞的膨胀与收缩程度，因为细胞膜是半透膜，只允许对自己有利的物质通过。同一物质在细胞内外的分布的数量不同，当某一种极溶于水的物质在细胞外浓度过大时，有可能导致细胞干瘪死亡，这些物质在细胞内过多时导致细胞过量吸水膨胀。细胞膜调节渗透压的能力是有限的。

　　(4)营养物

　　营养物和水一起，又叫细胞培养液，培养液中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。营养物包括：N 源、C源，这些物质与提供能量有关；无机盐、维生素、激素，这些物质与代谢调节控制有关。细胞培养液的设计一直是细胞离体培养技术的关键。理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物、调节物质的全部需要。在干细胞分化研究与应用中，关键是找到一种使干细胞分化成为所需细胞和组织的营养液。相同的人干细胞，放在不同的营养液中分化培养出人的各种脏器，这个昔日的梦想已经开始成为现实。植物细胞的组织培养技术已经基本完善配套。名贵花卉、中草药、脱毒马铃薯、组织培养莲菜苗等植物细胞与组织培养技术的不断完善，特别是由于组织培养液的商品化已经被广大农民普遍接受。

　　(5)水

　　水是细胞需要数量最大的物质，不同的物种、不同部位、不同生长期的细胞含水量差别相当大。干旱植物细胞的含水量高达90%。水的需求量一般随同细胞培养液一起考虑。

　　(6)无菌条件

　　体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。

　　(7)光

　　植物细胞和少数细菌需要利用光进行光合作用。

　　(8)气体

　　动物细胞需要不断供给氧气和排除二氧化碳，植物细胞与此相反。

　　2、动物细胞培养的特殊条件

　　在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。

　　(1)血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。有一天人们真正学会了配制和血清一样的培养液，那时血清才可被取代。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。

　　(2)支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。

　　(3)气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件，每一次开箱操作后的快速恢复对设备的要求可想而知有多难？由此决定了动物细胞离体培养设备要求高、投资大。

　　3、植物细胞培养的特殊条件

　　(1)光照：离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质，如药物的过程，植物细胞大多是在反应器中悬浮培养。

　　(2)激素：植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物细胞的分裂，生长，分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套广泛作为商品使用的培养液。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。

　　4、微生物细胞培养的特殊条件

　　微生物多为单细胞生物，野生生存条件比较简单。所以微生物人工培养的条件比动植物细胞简单得多。其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧的惰性气体浓度，而好氧微生物则只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件要求不如动植物细胞那样苛刻，玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等成为良好的微生物天然培养基。对于一些特殊微生物的营养条件要求，可以在这些天然培养基的基础上额外添加。