项目名称：对虾主要病毒性疾病 PCR 诊断技术试验示范（合同编号：2010GB2E100368）

项目来源：国家科技部农业科技成果转化资金

项目承担单位：广西壮族自治区兽医研究所

地址：广西南宁市友爱北路51号，邮编：530001

联系人：庞耀珊

电话及传真：0771-3120371

一、项目简介：

由国家科技部农业科技成果转化资金资助，重点对前期的本单位的研究成果——对虾主要病毒性疾病 PCR 诊断技术进行成果转化和试验示范。其中包括对虾白斑病、桃拉病、传染性皮下和造血器官坏死病三种病毒的常规PCR/RT-PCR试剂盒，一次性同时检测鉴别这三种病毒中任何2-3种病毒的多重PCR试剂盒，检测病毒含量的荧光实时定量PCR，一次性同时定量检测鉴别这三种病毒中任何2-3种病毒的多重荧光实时定量PCR。

二、技术原理：

根据聚合酶链式反应技术原理，利用白斑病毒、桃拉病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒的特异性引物和耐热性Taq DNA聚合酶，分别针对上述三种病毒基因组进行扩增，并通过扩增后所产生的特异性扩增产物来检测诊断相关病原。

三、技术范畴：

本项目技术属分子生物学基因诊断技术。

四、技术性能指标：

上述各种PCR及多重PCR检测试剂盒保存期在-20℃为12个月，-70℃为15个月，定性检测上述三种对虾病毒，6小时内完成检测，检测结果准确率达95%以上；荧光实时定量PCR及多重PCR定量检测上述三种对虾病毒，2小时内完成检测，检测结果准确率达95%以上。

五、技术特点：

项目承担单位拥有上述技术的自主知识产权，经广西区科技厅组织的专家组鉴定，上述技术具有创造性和先进性，达国内外同类技术的先进水平，其中多种技术为国际首创。

六、使用流程及工艺：

采样    提取基因组    PCR扩增   电泳   检测结果

七、所需仪器设备：

超净工作台、小型高速离心机（最大离心力不低于10000×g,或最高转速不低于12000rpm）、PCR仪或荧光定量PCR仪、电泳仪、紫外透射台等

八、技术成熟度、适用范围及安全性：

本项目技术成果已处于可正式大规模、大范围应用阶段；可应用于对虾养殖业白斑病、桃拉病、传染性皮下和造血器官坏死病的快速诊断。适用于科研院校、动物出入境及基层单位使用。检测中使用到的溴化乙锭（EB）有较强毒性，需按规定方法处理。

九、应用实例及经验：

1、取样：虾苗取样时去除眼柄即可，成虾则取表现异常的对虾的腮、内脏、血液，或有病变的其它部位。

2、病原基因组提取：利用试剂盒提供的基因组抽提试剂提取样品的总DNA或RNA。

3、PCR检测：用试剂盒提供的PCR试剂在PCR仪上扩增。

4、电泳染色：用1×TBE进行电泳、EB染色

5、  结果判断：在阴、阳性对照成立的前提下，样品扩增产物出现特定的电泳带可判断为相关病毒感染。

6、  结果示例图：