口蹄疫防控指南

　　殷宏 张永光 刘湘涛 李有全 吕见亮

　　（中国农业科学院兰州兽医研究所、国家口蹄疫参考实验室 兰州 730046）

　　一、牛口蹄疫免疫技术

　　根据我国目前的口蹄疫（口蹄疫以下用FMD表示） 防控状况、经济实力和周边国际环境，采取以免疫预防为主的综合控制政策，免疫预防我国近期控制FMD 的核心技术措施。

　　1 疫苗选择

　　目前对牛的免疫主要使用灭活疫苗。FMD 疫苗的毒型必须与所防控的FMD 毒型相一致，理论上免疫密度必须达到80%以上。我国第一个FMD 灭活疫苗由中国农业科学院兰州兽医研究所于1987年研制成功，目前我国FMD 灭活疫苗的生产工艺已十分成熟，产品符合国际标准，牛用疫苗主要有：牛羊用O、A、Asia1 型FMD 单价疫苗；O－A 型、O－Asia1 型FMD 双价疫苗；O－A－Asia1 型FMD三价疫苗。

　　2 免疫程序。

　　我国长期采用春、秋二季防疫，从传统意义的动物生长繁殖规律和疫病流行规律来分析是科学的。考虑到现代繁殖学的发展已使动物的生殖生长周期发生了较大变化，FMD 流行也已无明显季节性，为了保障免疫密度，可在春、秋防疫基础上，增加冬季免疫，以减少漏免，避免免疫间隔期过长。另外，由于牛的生长周期长，普通灭活疫苗免疫动物后3～4 个月，抗体水平快速下降。建议牛每4 个月免疫一次，并做好免疫抗体监测工作，对免疫不合格动物及时补免。

　　3 免疫剂量

　　足量免疫和正确的免疫途径是保证免疫质量的重要环节。在正常情况下，应按照疫苗使用说明书中所注明的免疫剂量、免疫途径操作，如属于紧急防疫接种，使用量可以加倍。

　　4 免疫操作

　　严格按照疫苗说明书进行操作。接种前，应对被接种动物进行详细的检查和了解，对怀孕母畜应调整免疫时间，尽量避免在临产2 周内注射疫苗，在配种期也应尽量避免接种疫苗。肌肉注射免疫，注意进针方向和深度，勿把疫苗打在脂肪层。所有生物制品对动物机体来说都是异物，接种动物后会出现一定程度的反应，FMD 疫苗也不例外。通过提高防疫人员的操作技术，严格按使用说明书操作，可减少因此造成的反应。发生严重反应时，可对该动物皮下注射1%肾上腺素进行抗过敏治疗。在疫点、疫区和受威胁区使用疫苗防控时，疫苗注射顺序应先从受威胁区开始，然后注射疫区、疫点的家畜。为了防止机械性的传播疫病，最好一头家畜一套注射器，如果注射器不够用，至少应做到一个栏一支针管，一头家畜一个针头。

　　二、口蹄疫诊断检测技术

　　对FMD 这样传播迅速、危害严重的传染病，尽早发现及确诊对于及时采取有效措施、防控疫情蔓延至关重要。

　　1 样品的采集

　　病料采集的好坏对于诊断结果的得出至关重要，以尚未溃破的水泡皮和水泡液为最好。其他样品包括鼻拭子、食道-咽部刮取物 （OP 液）、抗凝血或血清、牛奶等，死亡动物可采集淋巴结、扁桃体、脊髓及心脏。组织样品置 pH 7.2-7.6 的甘油缓冲液中冰冻保存。

　　2 病原检测

　　（1）病毒分离。检测口蹄疫的黄金标准，一般用犊牛甲状腺原代细胞分离牛源病毒，用猪肾细胞系 IBRS-2、PK-15 等分离猪源病毒。仓鼠肾细胞系 BHK-21，2-7 日龄的乳鼠也常用于分离FMDV。乳鼠接种FMDV 后 （24-72h），出现典型症状，表现为四肢麻痹、呼吸困难而死。

　　（2）补体结合试验CFT。国际通用的 FMD 经典检测和定型方法，于1943年建立。CFT 定型诊断的结果较为准确，但是敏感性不高，且易受样品中的亲补体物质和抗补体物质的干扰，已被间接夹心 ELISA 来代替。

　　（3）病毒中和实验。最经典和最权威的检测方法，常用做其它方法的参照，诊断结果可靠，缺点是要动用活毒只能在专门实验室进行，且工作量大、需要的时间长。

　　（4）反向间接血凝试验。将口蹄疫病毒的抗体以化学方法偶联于醛化的绵羊红细胞上，当贴附于血球的抗体与游离的抗原相遇并形成抗原一抗体凝集时，绵羊红细胞也随之凝集，出现了肉眼可见的血球凝集现象。该法简单、快捷，适合于基层使用，曾作为是我国 FMDV 鉴定的行业标准。

　　（5）间接夹心ELISA。又称抗原捕获 ELISA，该技术快速、敏感、准确，是OIE 推荐的定型的首选方法。还可用于分析制苗毒株株与流行毒之间的抗原相关性，推测相应的免疫保护力，评价疫苗毒的免疫覆盖率。

　　3 核酸检测

　　（1）RT-PCR 技术。《口蹄疫诊断技术》（GB/18935-2003）所列方法之一，现常用多重PCR。根据不同的目的，引物或为群特异性的，或为型特异性的。用于检测微量FMDV 核酸分子的多重RT-PCR试剂盒和用于定型检测的定型RT-PCR 试剂盒均获得了新兽药证书。

　　（2）核酸序列分析。核酸序列分析已成为 FMD 诊断的一种标准的诊断方法，它是将 PCR 与核酸序列测定相结合的一种方法。主要用于疫源追踪、分子流行病学调查、型别鉴定和毒株的遗传演化分析。

　　4 抗体检测

　　（1）病毒中和试验 （VNT）。VNT 是OIE 推荐的检测 FMDV 抗体的标准方法。多年来，许多实验室用该方法评价疫苗效力和检测动物免疫水平。试验方法有以下四种：乳鼠中和试验、常量细胞中和试验、微量细胞中和试验（国际贸易指定方法）和空斑减少中和试验。我国卢永干等 （1984）建立了FMDV 细胞中和试验，一直用于进出境动物检疫及流行病学调查。

　　（2）正向间接血凝试验。正向间接血凝试验的原理与反向间接血凝试验相同，只是用提纯的口蹄疫病毒分别致敏于醛化绵羊红细胞上，用于检测动物血清中口蹄病毒的抗体水平。

　　（3）液相阻断夹心ELISA。液相阻断ELISA（LPB-ELISA）将定量的灭活抗原与系列稀释血清在液相状态下充分结合，待检血清中若含有某型抗体，必然与同型病毒抗原结合，将上述混合液转入已用各型相应捕获抗体包被好的 ELISA 板中之后，依次加入检测抗体、酶标二抗、底物、终止液，最后用酶标仪判读结果。LPB-ELISA 适合于大批量血清样品的检测。是国际认可的一种标准化诊断技术。目前已有商品化O、A、Asia1 型LPB-ELISA 试剂盒。

　　5 自然感染与注苗动物的鉴别诊断

　　（1）免疫扩散试验。FMDV 感染相关抗原（VIA 抗原）琼脂扩散试验用于检测自然感染动物与注苗动物。我国1987 年建立了该方法，曾用于出入境活畜的检疫和流行病学调查。目前已被非结构蛋白ELISA 替代。

　　（2）FMD 病毒的非结构蛋白ELISA。非结构蛋白（NSP）大多与病毒的复制和装配相关，由于目前使用的 FMD 疫苗主为灭活疫苗，免疫动物后没有病毒增殖，就没有病毒特异性NSP 表达，也就不会产生 NSP 抗体。而自然感染动物体内则有病毒增殖，需要 NSP 参与，由此刺激动物机体产生了相应得抗体，因此可以利用 NSP 抗体来区分自然感染动物与疫苗免疫动物。FMDV NSP 主要有L、2B、2C、3ABC 和3D，感染动物3ABC 抗体产生早（感染后 3-4 天），而且持续时间长（一年以上），是衡量感染与免疫动物最可靠的一项指标，国内外许多实验室已建立了检测3ABC 抗体的ELISA 方法。

　　6 FMD 诊断新技术开发

　　（1）固相竞争ELISA。该法近年来列入OIE 诊断和疫苗标准手册中。SP-ELISA的特异性超过好，动物在感染 FMDV 8 天后检测，敏感性可达 100% 。与 LPB-ELISA 相比，SP-ELISA 只需浓缩的、半纯化的灭活全病毒 146S 做抗原，即可检测 FMDV 的抗体，并具有更高的特异性和好的开发前景。研制的SP-ELISA 近期正在申报新兽药证书。

　　（2）口蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体Dot-blot 技术。由于我国目前生产FMD 疫苗的工艺，疫苗中仍含有少量的非结构蛋白，动物反复免疫（尤其是奶牛免疫次数较多）会产生一定数量的非结构蛋白抗体阳性畜。为提高诊断的特异性，建立了Dot-blot 方法，用原核表达纯化3ABC、3D、3A、3B、2C 五种NSPs，印迹于硝酸纤维素膜（NC 膜），制成有五个圆形斑点的印迹膜条，检测时加血清与不同的NSP 结合，加酶标抗体与底物作用后显圆形斑点。判定标准为：阴性血清没有斑点显色或有1-3个斑点显色，阳性血清有4 或5 个斑点显色。最终显色结果通过肉眼就可以判定，不需要用仪器判读，操作更简便，整个反应过程约为2.5 小时。

　　（3）实时荧光定量RT-PCR。在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前技术已经比较成熟。

　　（4）环介导等温扩增技术（LAMP）。2000 年，日本学者 Notomi等建立了LAMP 技术，它是利用 2 对特殊设计的引物和一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶，在恒温条件下特异、高效地扩增靶序列的新技术，反应伴有白色的副产物焦磷酸镁沉淀产生，可通过肉眼定性判断反应结果。该方法可以不需仪器即时观察，非常适合于基层及现场使用。目前技术已趋于成熟。

　　（5）免疫层析试纸条。20 世纪 90 年代以来在单克隆抗体技术、免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。将特异性的抗原（或抗体）以条带状固定于硝酸纤维膜上，将可显色的标记物（如胶体金或有色乳胶微球）吸附在结合垫上。当待测样品（如血清、尿液或水泡液）加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解固化的结合垫上的标记物后相互反应，再移动至固定的抗原（或抗体）的区域时，待测物和标记物的复合物又与之发生特异性结合而被截留积聚，

　　从而在检测带上出现可以目测的显色结果。该技术快速（10 分钟就可出结果）、简便，不需其它任何仪器设备，可随时随地进行，特别适合用于基层现场检测。目前已研制出检测抗原或抗体的试纸条。

　　（6）邻位连接技术是一种高灵敏度的蛋白质体外分析检测新技术，该技术将对蛋白质的检测转变为对 DNA 核酸序列的检测，实现了痕量蛋白质的定量、定位检测，具有极高的敏感性和特异性。基因芯片技术融合了生命科学、化学、微电子学、计算机科学、统计学和生物信息学等诸多学科领域的成就，具有快速、高通量、高度并行性等特点。生物传感器也是多学科交叉和各种高新技术结和的产物，其基本原理是将分子识别元件如酶、抗原、抗体、细胞、细胞器、组织、微生物等生物活性物质感知的变化转换成可测量的电信号或光信号。相信随着研究的深入，这些技术将会成为口蹄疫等水泡性疾病诊断的有力武器。

　　三、口蹄疫消毒技术

　　1 消毒方法

　　消毒的目的是消灭被传染源散布于外界环境中的病原体，以切断传播途径，阻止疫病继续蔓延。无疫情阶段主要采取预防性消毒。在疫情发生时，为了及时消灭从病畜体内排出的病原体而采取随时消毒措施。消毒时应注意几个要点：用药恰当，不用相互拮抗的药物；配药浓度要准确，宁高勿低；消毒时的温度要适宜，控制在5℃以上；时间足够长，或宁长勿短；湿度控制，喷雾消毒时宁干勿温，熏蒸消毒时要有一定湿度，便于气体扩散。

　　2 消毒剂选择

　　根据消毒目的、消毒对象的特性及环境因素，选用合适的消毒剂。醛类中常用的有甲醛、戊二醛。过氧化物类中的过氧乙酸、过氧化氢等都是高效消毒剂，用0.1%-0.5%过氧乙酸喷雾消毒能杀灭FMD病毒。含氯化合物，如漂白粉、次氯酸钙、二氯异氰脲酸、二氯异氰脲酸钠等是杀灭口蹄疫病毒特有效的消毒剂，多用于水和疫源地的消毒。含碘消毒剂，如碘酊、碘伏等对口蹄疫病毒有一定的杀灭作用。FMD 病毒对pH 敏感，因而酸类消毒剂对它有强大的杀灭作用，0.2%柠檬酸溶液加入适当的清洁剂，可以改善其效力，适用于场地、装置、容器等的消毒。氢氧化钠常配成1-2%的热水溶液消毒被病毒污染的畜舍、地面和用具等。酚类消毒剂对FMD 病毒杀灭力较弱。特别注意的是口蹄疫病毒是无囊膜的病毒，对脂溶剂（如乙醚、氯仿、丙酮、三氯乙烯等）有抵抗力。在我国《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020 年）》中，对口蹄疫的防治目标为：到2020年，Ａ型全国达到免疫无疫标准；Asia1 型全国达到非免疫无疫标准；O 型，海南岛、辽东半岛、胶东半岛达到非免疫无疫标准，北京、天津、辽宁（不含辽东半岛）、吉林、黑龙江、上海达到免疫无疫标准，其他区域维持控制标准。要达到这个目标，时间紧任务重，必须调动一切可用资源，科学防控制。

　　（肉牛牦牛产业技术体系疫病控制功能研究室 供稿）