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水牛活体采卵体外生产胚胎技术的研究*
  时间:2007-11-2     来源:    编辑:gxbreed
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 梁贤威 张秀芳 杨炳壮 陈明棠 黄芬香 庞春英 廖朝辉 覃广胜 韦升菊 黄右军

(中国农科院广西水牛研究所,广西南宁530001

 

摘要  本研究应用B超引导阴道穿刺法,对40头尼里-拉菲和摩拉水牛连续3次采卵,采卵间隔为3天,共采卵120头次。共穿刺卵泡935个,采集卵母细胞643枚,可用卵母细胞为456枚,卵母细胞回收率为68.77%643/935),卵母细胞可用率为70.92%456/643)头均可用卵母细胞为3.80±0.23个。第123次采卵头均回收可用卵母细胞数分别为3.82±0.503.82±0.354.05±0.43枚,差异不显著(P<0.05)。收集的卵母细胞经体外成熟、体外受精和受精卵与颗粒细胞单层体外共培养,受精后48h分裂率为56.36%257/456),囊胚率为20.39%93/456)。两个品种水牛在头均可采卵泡、头均回收卵母细胞和囊胚率均无显著差异。结果表明,在B超引导下进行连续活体采卵,并利用卵母细胞进行体外受精生产胚胎是可行的。

   关键词: 水牛, B超引导阴道穿刺, 活体采卵,  体外受精

 

1988年,Pieterse[1]发明了B型超声波引导活体采卵法,经子宫壁采集牛卵母细胞,经过十几年的发展,在牛上获得了较为广泛的应用。水牛由于其繁殖生理的特殊性,致使超数排卵及其胚胎回收效果较差,且水牛个体对激素反应差异很大,限制了超数排卵的应用[2_3]。而活体采卵可重复从遗传价值高的水牛采集卵母细胞,其与体外受精技术相结合可生产大量系谱明确的胚胎。与传统的超数排卵-胚胎回收相比,水牛活体采卵-体外胚胎生产技术具有许多优点,可克服母畜生殖道疾病对胚胎质量的影响,每头供体每月可生产更多的可移植胚胎(2.0vs0.6 [4]。活体采卵与体外受精和胚胎移植相结合,可充分利用优良母畜的遗传潜力,缩短家畜世代间隔,从而加速水牛的遗传改良进程。本研究旨在应用活体采卵结合体外受精技术,生产出系谱明确的良种水牛胚胎,以探讨加快良种水牛扩繁的新途径。

1 材料与方法

1.1 供试牛

40头健康、繁殖机能正常的空怀摩拉和尼里-拉菲母水牛,年龄5~12岁,体重580~720 kg,体况良好,饲养在半封闭式牛舍。将供体牛随机分为4组,每组10头。

1.2 试验用品

本研究所用试剂均为Sigma公司产品。采卵液为改良磷酸缓冲液(DPBS),添加100µg/ml青霉素、60µg/ml链霉素、6µg/ml肝素钠和3%新生牛血清(NBS)。活体采卵仪为日本Honda公司生产的HS2000B型超声波显像仪,阴道扇形扫描探头(Aloka),60 cm长采卵针,真空泵和恒温槽以及胚胎过滤杯等。

体外受精液为改良TyrodeS+60µg/ml肝素钠;受精卵培养液为TCM199+10%新生牛血清(NBS)。卵母细胞受精24h后转入颗粒细胞单层培养,每2d换液1次,直到培养结束。IVMIVFIVC均在39℃、5%CO2、饱和湿度的条件下进行。

1.3 卵母细胞的采集

对供体水牛进行保定,清除直肠粪便,清洗并清毒外阴后,将B超探头套上避孕套,在探头前端涂抹润滑剂。操作者左手经直肠把握固定卵巢,右手将安装有采卵针的探头缓慢插入阴道穹隆处采卵一侧,并将卵巢牵引紧贴在探头前端,这时从B超显示器上可显示出卵巢图像和卵泡位置、大小,前后左右翻转卵巢,记录卵泡数,调节真空泵压力为40~60 mm汞柱,推动采卵针穿刺卵泡,同时用脚踏开关启动真空泵进行采卵,采完一头供体后,迅速将回收液送回实验室收集卵母细胞。

1.4 卵母细胞体外成熟

将回收液倒入胚胎过滤杯,用含3%NBSDPBS清洗2-3次,在体视镜下收集卵母细胞,将收集的卵母细胞分级,完整包被二层以上卵丘细胞且细胞质均匀的卵母细胞为A级;附着一层卵丘细胞且细胞质均匀的为B级;裸卵和虽附着卵丘细胞但细胞质不均匀的为C级,D级为卵丘细胞扩散的卵母细胞。AB级用于体外成熟培养,CD级则弃去不用。卵母细胞在含5%NBS20mMHepesTCM199液中洗2次,再用体外成熟液洗1次,转入50uL/滴的培养液中培养,每头供体的卵母细胞单独培养,体外成熟液为TCM199+10%胎牛血清+50µM半胱胺+10µg/ml FSH+12 U/mI LH+1µg/ml E2,卵母细胞在395 %CO2,最大相对湿度的培养箱中成熟22~24 h

1.5 体外受精

实验用摩拉和尼里-拉菲水牛细管冻精均购自广西壮族自治区畜禽品种改良站。精子处理液采用含0.3%BSASperm-TALP,受精液采用含0.6%BSA+60µg/ml肝素钠的Fert-TALP。解冻后将精液悬浮于3ml预热的洗精液中上游1h以分离活精子,2000rpm/5min离心收集上清液,活精子沉淀后再用3ml受精液离心洗一次。

体外成熟22~24h的卵母细胞,经精子处理液洗2次,受精液洗1次后,转移到覆盖石蜡油的30µL/滴的受精液滴中,加入经上浮法处理的精子,调节最终精子浓度为2×106/mL,培养条件同体外成熟,精子和卵子共同孵育22~24 h

1.6 早期胚胎的体外培养

受精后的卵母细胞用含5%NBSHepes-TCM1992~3次,吸管反复吹打去除卵丘细胞后,再用含10%NBSTCM199液洗1次,转入颗粒细胞单层液滴,放入39℃5 %CO2,饱和湿度的CO2培养箱中培养。培养液每2d换半液,受精48h后检查受精卵分裂率,第5~10天观察囊胚发育情况。

1.7 数据统计分析

所得数据平均数采用T检验进行比较,方差分析进行多重比较,百分数则采用卡方检验。

2 结果与分析

2.1 活体采卵前后水牛卵巢卵泡发育的变化

通过B超观察了40头摩拉、尼里-拉菲水牛在活体采卵前后卵泡发育情况,结果如表1所示,试验共观察了卵泡935个,发现水牛卵巢的卵泡仍以2~5mm直径的小卵泡为主,小卵泡、中卵泡和大卵泡比例分别为85.98%8.88%5.56%

1 采卵前后水牛卵巢卵泡发育的变化

Table 1 Effect of OPU Replicate on Follicle Recruitment

组别

Treament

观察头数

Replicates

小卵泡

Small follicles

(2-5mm)

中卵泡

Medium follicle

(5-10mm)

大卵泡

Large follicle

(>10mm)

合计

Tot.

1

1st  OPU

40

319 (86.44)

20 (5.96)

30 (7.13)

369

2

2nd OPU

40

232 (86.24)

26 (9.67)

11 (4.09)

269

3

3rd OPU

40

253 (85.19)

35 (11.78)

10 (3.6)

297

合计

Tot.

120

804 (85.98)

83 (8.88)

52 (5.56)

935

2.2 不同活体采卵批次的采卵效果

本研究对20头摩拉和尼里-拉菲水牛分别连续采卵三次,共穿刺了935个可视卵泡,采卵结果如表2、表3所示。

2 不同活体采卵批次的采卵效果

Table 2 Effect of OPU Replicate on Oocyte Recovery

组别

Treatment

采卵头次

Replicates

穿刺卵泡数

Follicles aspirated

回收卵母细胞

Oocytes recovered

可用卵母细胞

Oocytes used

卵母细胞回收率%

Recovery rate

1

1st  OPU

40

9.23±0.71 aA

6.45±0.83 aA

3.63±0.50

69.91

2

2nd OPU

40

6.72±0.36 bB

4.60±0.44 B

3.72±0.35

68.40

3

3rd OPU

40

7.43±0.50 b

5.03±0.49 b

4.05±0.43

67.68

合计

Tot.

120

7.69±0.33

5.36±0.35

3.80±0.23

68.77

(Note)ABP< 001abP <O05

 

3 不同活体采卵批次对水牛卵母细胞质量的影响

     Table 3 Effect of OPU Replicate on Oocyte Quality

组别

Treament

采卵头次

Replicates

回收卵母细胞质量 Oocyte quality

可用卵母细胞

Usable oocytes

(%)

回收总数

Oocytes Recovered

A

Grade A

(%)

B

Grade B

(%)

C

Grade C

(%)

D

Grade D

(%)

空透明带

Only Zona

(%)

1

1st  OPU

40

39

(15.12)

106

(41.09)

61

(23.64)

24

(9.30)

28

(10.85)

145

(56.20) A

258

2

2nd OPU

40

28

(15.22)

121

(65.76)

22

(11.95.

8

(9.30)

8

(10.85)

149

(80.98) B

184

3

3rd OPU

40

18

(17.41)

127

(63.18)

22

(10.95)

6

(2. 99)

11

(5.47)

162

(80.60) B

201

合计

Tot.

120

102

(15.86)

354

(55.05)

105

(16.33)

38

(5.91)

47

(7.31)

456

(70.92)

643

2.3 活体采集水牛卵母细胞的体外受精效果

活体采集的462个水牛卵母细胞,体外受精48h后分裂率为55.63%,第1次采卵回收的卵母细胞体外受精分裂率明显低于第23次,分别为46.67%58.82%62.50%;而各批次活体采集的卵母细胞经体外受精后囊胚率分别为18.79%16.9925.00%,差异不显著(P0.05)。

4  不同活采批次卵母细胞体外受精效果

Table 4 Effect of OPU Replicate on In-vitro Fertilization

组别

Group

卵数

Oocytes

分裂

Cleavages

分裂率 %

Cleavage rate

囊胚

Blastocysts

囊胚率%

Blastocyst rate

1

First OPU

165

77

46.67 (77/165) aA

31

(18.79)

2

Second OPU

153

90

58.82 (90/153) b

26

(16.99)

3

Third OPU

144

90

62.50 (90/144) bB

36

(25.00)

合计

Tot.

462

257

55.63 (257/462)

93

(20.13)

2.4 不同品种水牛活体采卵和体外受精比较

摩拉、尼里-拉菲水牛每头次可采卵泡数、头均回收卵母细胞数、头均可用卵母细胞和回收率均差异不显著(P>0.05),活体采集的摩拉水牛和尼里-拉菲水牛卵母细胞体外受精后囊胚率分别为21.25%18.92%,差异也不显著(P>0.05)。详见表5和表6

5  不同品种水牛活体采卵效果

Table 5 Effect of Buffalo Breed on Oocyte Recovery

品种

Breed

采卵头次

Replicates

穿刺卵泡数

Follicles aspirated

回收卵数

Oocytes recovered

可用数

Oocytes

used

卵母细胞回收率%

Recover rate

摩拉

Murrah

60

7.82±0.41

5.51±0.41

3.96±0.24

70.02

尼里-拉菲

Nili-Ravi

60

7.60±0.52

5.20±0.30

3.63±0.31

67.41

 

6 不同品种水牛活体采集卵母细胞体外受精效果

Table 6 Effect of Buffalo Breed on In-vitro Fertilization

品种

Breed

卵数

Oocytes

分裂

Cleavage

分裂率

Cleavage rate

囊胚

Blastocyst

囊胚率

Blastocyst rate

摩拉

Murrah

240

137

57.08 (137/240)

51

21.25 (51/240)

尼里-拉菲

Nili-Ravi

222

120

54.05 (120/222)

42

18.92 (42/222)

 

3.讨论

本研究发现,无论是摩拉或是尼里-拉菲水牛,卵巢的卵泡均以2~5mm直径卵泡为主,比例达85.98%。采卵前后小卵泡比例变化不大,但大卵泡比例有所下降,由采卵前的7.13%下降至第3次采卵前的3.6%,而中等直径卵泡则略有增加,由5.96%增加至11.78%

活体采卵的优点在于可以长期反复在活体上采集卵母细胞。本次研究共连续进行了3次采卵试验,结果平均每头次穿刺卵泡为7.69±0.33个,明显高于Yadav [5]报道经eCG处理的青年水牛和经产水牛,每头水牛卵巢上有5.12个可采卵泡,且也高于Boni等[6]FSH-P处理卵巢发育障碍且长期不发情的6头水牛可获穿刺卵泡的数量(处理和未处理分别为6.75与4.1枚),但与先前的Promdireg A.[7]FSH激素处理沼泽型发情水牛5头和产后泌乳水牛6所获的卵泡数(发情水牛和产后泌乳水牛分别为7.2±3.7和9.0±3.2枚)和黄右军等 [8]研究报道(7.94枚)的相似。

在连续进行采卵时发现,第123次采卵平均穿刺卵泡数和头均回收的卵母细胞数虽存在差异,但头均可用卵母细胞数并无差异。本研究平均每头次采卵可回收5.36±0.35枚卵母细胞,这与Techkumphu M等[9]利用9头初情前小母水牛经FSH超排处理后活采平均每头次可回收卵母细胞5.4±3.7枚和Promdireg A.[7]研究的产后泌乳水牛获5.9±3.5枚相似,Yadav[5]报道仅为2.85±0.28枚卵母细胞,Boni[10]2.71±1.75枚,Gerber[11]2.5枚,Gali[12]4.1枚,Promdireg A.[7]研究的沼泽型发情水牛为3.7枚。平均卵母细胞回收率为68.77%,第123次采卵回收率差异不显著。而一些作者报道的为43-55%[101314],这可能是由于供体水牛品种、生理状态、营养状况和采卵者技术水平不一所致。

本次试验结果表明(见表3),活体采集水牛卵母细胞以A、B级卵母细胞为主,平均卵母细胞可用率达70.92%,与Yadav等[5]报道的经eCG处理的摩拉母水牛活体采卵回收率(71.60%),未经处理的摩拉水牛卵母细胞平均回收率(64.18%)相似(2006)1次采卵卵母细胞可用率仅为56.20%,第2、3次采卵可用率却上升至80.98%和80.60%,差异极显著(P<0.01)。这是由于第1次采卵时闭锁卵泡较多,随采卵次数增加,闭锁卵泡减少,卵母细胞质量提高,因而回收的可用卵母细胞比例也随之增加,但每次活采头均获可用卵母细胞数没有差异,第1、2、和3次分别为3.63±0.50、3.72±0.35和4.05±0.43。由此说明,间隔3d连续活体采集水牛卵母细胞是可行的。这结果与先前报道的相似[8]。值得注意的是,本次试验回收卵母细胞中平均裸卵率为16.33%,虽低于Yadav报道的39.9%,但仍有7.31%的空透明带,可能是采卵时所用的抽吸真空负压可能过大所造成。

本研究平均囊胚为20.13%, 略高于Boin等[10]活体采集意大利地中海奶水牛卵母细胞体外生产胚胎的囊胚率(为16.7%);而与Neglia G.等[15] 用8头干奶期的奶水牛进行活采体外生产的囊胚率 19.9±4.2%相似,但显著低于黄右军等[8]报道的活体采集卵母细胞体外受精的囊胚率(30.2%)和Kitiyanant等[16]应用6头经同期发情母水牛(3-5岁)活采后的体外受精囊胚率(26.7%)。这可能是由于本实验将每头供体的卵母细胞单独培养,绝大多数为1~6个/滴,每个液滴培养卵数太少所致。

研究发现,利用摩拉、尼里-拉菲水牛进行活体采集卵母细胞,虽然每头次可采卵泡数、头均回收卵母细胞数、头均可用卵母细胞和回收率以及其体外受精效果差异不显著,但不同个体卵泡再生的差异较大,个体间每次采卵回收的卵母细胞数变异仍较大(0-15枚不等)。由此说明,为了提高活体采卵的效果,加强供体牛的个体选择是十分重要的。Gasparini等[4]之前的报道也证实这个观点。

 

参考文献

[1] Pieterse MCKappen KA,Kruip ThAM et a1Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries[J].TheriogenoIogy l988,3075l762

[2] Misra AK, Kasiraj R, Mutha Rao M, Rangareddy NS and Pant HC. Embryo Transfer Technology in the Buffalo: Our Experience and Future Prospects [J]. Bubalus bubalis 1999; IV: 63-74.

[3] Misra AK, Prasad Shiv and Taneja, VK. Embryo transfer technology (ETT) in cattle and buffalo in India: A review [J]. Indian J. Anim. Sci. 2005; 75(7):842857.

[4] Gasparrini B. In vitro embryo production in buffalo species: state of the art [J]. Theriogenology 2002; 57: 237-256.

[5] Yadav S.K., Misra A.K., Sharma R, Prasad Shiv, Gupta H.P (2006) Repeated trans-vaginal ultrasound guided aspiration of oocytes (OPU) from Murrah buffaloes. Proceedings of the 5th Asia Buffalo Congress, Nanning China, 2006:621627.

[6] Boni R, Di Palo R, Barbieri V, Zicarelli L. Ovum pick-up in deep anestrus buffaloes. Proc IV World Buffalo Congress 1994;3:480-482..

[7] Promdireg A., Adulyanubap W.,et al. Ovum pick-up in cyling and lactating postpartum swamp buffaloes(Bubalus Bubalis). Reprod.Dom.Anim.2005;40:145-149.

[8] 黄右军, Presicce, GA, Gasparrini,B. 水牛活体采卵及体外受精研究[J].中国畜牧兽医 2004,(11)22~24.

[9] Techakumphu M, Promdireg A et al. Repeated oocyte pickup in prepubertal swamp buffalo (Bubalus Bubalis) calves after FSH superstimulation. Theriogenology 2004; 61:1705-1711.

[10]Boni R, Roviello S and Zicarelli L. Repeated ovum pick up in Italian Mediterranean buffalo cows [J]. Theriogenology 1996 46: 899-909.

[11] Gerber D, Arlotto T and Cooper D.  A new disposable needle guide system for transvaginal oocyte recovery in domestic cows and African buffalo [J]. Theriogenology 2000; 53:333.

[12] Galli C, Duchi R, Crotti G and Lazzari G. Embryo production by ovum pick up in water buffalo [J]. Theriogenology 1998; 49: 400.

[13]Manik R S, Chauhan MS, Singla SK, and Palta P. Transvaginal ultrasound-guided aspiration of follicles from Indian buffaloes (Bubbalus bubalis) with reproductive problems[J]. Vet Rec 2002; 150: 22-24.

[14] Techakumphu M, Promidireg A, Phutikanit N, Nachiengmai A and Thingion S. (2004a). Transvaginal follicle aspiration in thai swamp buffalo heifers using different vaccume pressure after FSH pretreatment (Bubalus bubalis) [J]. J Vet Med Sci 68(8): 973-975.

[15]Neglia G,Gasparrini B et al . Bovine and buffalo in vitro embryo production using oocytes derived from abattoir ovaries or collected by transvaginal follicle aspiration.  Theriogenology 2003; 59:1123-1130.

[16] Kitiyanant Y, Tocharus C.et al. Swamp buffalo oocttes from transvaginal ultrasound-guided aspiration fertilized and co-cultured in vitro with bovine oviductal epithelial cells. Theriogenology 1995; 43:250.

 

 

Ovum Pick-Up and In-vitro Embryo Production in Water Buffalo

LIANG xian-wei,ZHANG xiu-fang, YANG bing-zhuang, CHEN ming-tang, HUANG fen-xiang,

PANG chun-ying, LIAO chao-hui, QIN guang-sheng, WEI sheng-ju, HUANG you-jun

(Guangxi Buffalo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530001, P. R of China   )

 

Abstract: Transvaginal ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) was performed on 40 Nili-Ravi and Murrah buffaloes for consecutive 3 times each, at an interval of 3 days. A total of 935 follicles were aspirated, 643 oocytes were retrieved, while 456 oocytes of them were usable. The recovery rate was 68.77%643/935, and the percentage of usable oocytes was 70.92%456/643, an average of 3.80±0.23 oocytes were usable for per buffalo. The number of usable oocytes for the first, second and third OPU was 3.82±0.503.82±0.354.05±0.43, respectively, the difference among them was not significantP<0.05. After in-vitro maturation (IVM), in-vitro fertilization (IVF) and co-incubation with single layer of granular cells, the cleavage rate was 56.36%257/456, blastocyst formation rate was 20.39%93/456. There’s no significant difference between the two breeds on aspirated follicles, recovery rate of oocytes and blastocyst formation rate of per buffalo. The results proved the feasibility of in-vitro embryo production of oocytes obtained by transvaginal ultrasound-guided consecutive OPU.

KeywordsWater buffalo, Transvaginal ultrasound-guided aspiration, Ovum pick-up (OPU), In-vitro fertilization (IVF)

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黄沙鳖
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鳖类中含有18种氨基酸其中色氨酸在测定过程中,经酸水解..
古典三黄鸡
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古典型岑溪三黄鸡体形小巧,外貌华丽,肉嫩骨细,极富野味..
最新价格行情 养殖技术
2023年9月20日我区水产畜牧产 9-22
2023年9月10日我区水产畜牧产 9-11
2023年8月30日我区水产畜牧产 9-1
2023年8月20日我区水产畜牧产 8-23
2023年8月10日我区水产畜牧产 8-12
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致富经验
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