梁贤威 张秀芳 杨炳壮 陈明棠 黄芬香 庞春英 廖朝辉 覃广胜 韦升菊 黄右军
(中国农科院广西水牛研究所,广西南宁530001)
摘要 本研究应用B超引导阴道穿刺法,对40头尼里-拉菲和摩拉水牛连续3次采卵,采卵间隔为3天,共采卵120头次。共穿刺卵泡935个,采集卵母细胞643枚,可用卵母细胞为456枚,卵母细胞回收率为68.77%(643/935),卵母细胞可用率为70.92%(456/643)头均可用卵母细胞为3.80±0.23个。第1、2、3次采卵头均回收可用卵母细胞数分别为3.82±0.50,3.82±0.35,4.05±0.43枚,差异不显著(P<0.05)。收集的卵母细胞经体外成熟、体外受精和受精卵与颗粒细胞单层体外共培养,受精后48h分裂率为56.36%(257/456),囊胚率为20.39%(93/456)。两个品种水牛在头均可采卵泡、头均回收卵母细胞和囊胚率均无显著差异。结果表明,在B超引导下进行连续活体采卵,并利用卵母细胞进行体外受精生产胚胎是可行的。
关键词: 水牛, B超引导阴道穿刺, 活体采卵, 体外受精
1988年,Pieterse等[1]发明了B型超声波引导活体采卵法,经子宫壁采集牛卵母细胞,经过十几年的发展,在牛上获得了较为广泛的应用。水牛由于其繁殖生理的特殊性,致使超数排卵及其胚胎回收效果较差,且水牛个体对激素反应差异很大,限制了超数排卵的应用[2_3]。而活体采卵可重复从遗传价值高的水牛采集卵母细胞,其与体外受精技术相结合可生产大量系谱明确的胚胎。与传统的超数排卵-胚胎回收相比,水牛活体采卵-体外胚胎生产技术具有许多优点,可克服母畜生殖道疾病对胚胎质量的影响,每头供体每月可生产更多的可移植胚胎(2.0vs0.6) [4]。活体采卵与体外受精和胚胎移植相结合,可充分利用优良母畜的遗传潜力,缩短家畜世代间隔,从而加速水牛的遗传改良进程。本研究旨在应用活体采卵结合体外受精技术,生产出系谱明确的良种水牛胚胎,以探讨加快良种水牛扩繁的新途径。
1 材料与方法
1.1 供试牛
40头健康、繁殖机能正常的空怀摩拉和尼里-拉菲母水牛,年龄5~12岁,体重580~720 kg,体况良好,饲养在半封闭式牛舍。将供体牛随机分为4组,每组10头。
1.2 试验用品
本研究所用试剂均为Sigma公司产品。采卵液为改良磷酸缓冲液(DPBS),添加100µg/ml青霉素、60µg/ml链霉素、6µg/ml肝素钠和3%新生牛血清(NBS)。活体采卵仪为日本Honda公司生产的HS2000B型超声波显像仪,阴道扇形扫描探头(Aloka),60 cm长采卵针,真空泵和恒温槽以及胚胎过滤杯等。
体外受精液为改良Tyrode’S+60µg/ml肝素钠;受精卵培养液为TCM199+10%新生牛血清(NBS)。卵母细胞受精24h后转入颗粒细胞单层培养,每2d换液1次,直到培养结束。IVM、IVF和IVC均在39℃、5%CO2、饱和湿度的条件下进行。
1.3 卵母细胞的采集
对供体水牛进行保定,清除直肠粪便,清洗并清毒外阴后,将B超探头套上避孕套,在探头前端涂抹润滑剂。操作者左手经直肠把握固定卵巢,右手将安装有采卵针的探头缓慢插入阴道穹隆处采卵一侧,并将卵巢牵引紧贴在探头前端,这时从B超显示器上可显示出卵巢图像和卵泡位置、大小,前后左右翻转卵巢,记录卵泡数,调节真空泵压力为40~60 mm汞柱,推动采卵针穿刺卵泡,同时用脚踏开关启动真空泵进行采卵,采完一头供体后,迅速将回收液送回实验室收集卵母细胞。
1.4 卵母细胞体外成熟
将回收液倒入胚胎过滤杯,用含3%NBS的DPBS清洗2-3次,在体视镜下收集卵母细胞,将收集的卵母细胞分级,完整包被二层以上卵丘细胞且细胞质均匀的卵母细胞为A级;附着一层卵丘细胞且细胞质均匀的为B级;裸卵和虽附着卵丘细胞但细胞质不均匀的为C级,D级为卵丘细胞扩散的卵母细胞。A、B级用于体外成熟培养,C、D级则弃去不用。卵母细胞在含5%NBS和20mMHepes的TCM199液中洗2次,再用体外成熟液洗1次,转入50uL/滴的培养液中培养,每头供体的卵母细胞单独培养,体外成熟液为TCM199+10%胎牛血清+50µM半胱胺+10µg/ml FSH+12 U/mI LH+1µg/ml E2,卵母细胞在39℃、5 %CO2,最大相对湿度的培养箱中成熟22~24 h。
1.5 体外受精
实验用摩拉和尼里-拉菲水牛细管冻精均购自广西壮族自治区畜禽品种改良站。精子处理液采用含0.3%BSA的Sperm-TALP,受精液采用含0.6%BSA+60µg/ml肝素钠的Fert-TALP。解冻后将精液悬浮于3ml预热的洗精液中上游1h以分离活精子,2000rpm/5min离心收集上清液,活精子沉淀后再用3ml受精液离心洗一次。
体外成熟22~24h的卵母细胞,经精子处理液洗2次,受精液洗1次后,转移到覆盖石蜡油的30µL/滴的受精液滴中,加入经上浮法处理的精子,调节最终精子浓度为2×106个/mL,培养条件同体外成熟,精子和卵子共同孵育22~24 h。
1.6 早期胚胎的体外培养
受精后的卵母细胞用含5%NBS的Hepes-TCM199洗2~3次,吸管反复吹打去除卵丘细胞后,再用含10%NBS的TCM199液洗1次,转入颗粒细胞单层液滴,放入39℃、5 %CO2,饱和湿度的CO2培养箱中培养。培养液每2d换半液,受精48h后检查受精卵分裂率,第5~10天观察囊胚发育情况。
1.7 数据统计分析
所得数据平均数采用T检验进行比较,方差分析进行多重比较,百分数则采用卡方检验。
2 结果与分析
2.1 活体采卵前后水牛卵巢卵泡发育的变化
通过B超观察了40头摩拉、尼里-拉菲水牛在活体采卵前后卵泡发育情况,结果如表1所示,试验共观察了卵泡935个,发现水牛卵巢的卵泡仍以2~5mm直径的小卵泡为主,小卵泡、中卵泡和大卵泡比例分别为85.98%、8.88%和5.56%。
表1 采卵前后水牛卵巢卵泡发育的变化
Table 1 Effect of OPU Replicate on Follicle Recruitment
组别
Treament |
观察头数
Replicates |
小卵泡
Small follicles
(2-5mm) |
中卵泡
Medium follicle
(5-10mm) |
大卵泡
Large follicle
(>10mm) |
合计
Tot. |
第1次
1st OPU |
40 |
319 (86.44) |
20 (5.96) |
30 (7.13) |
369 |
第2次
2nd OPU |
40 |
232 (86.24) |
26 (9.67) |
11 (4.09) |
269 |
第3次
3rd OPU |
40 |
253 (85.19) |
35 (11.78) |
10 (3.6) |
297 |
合计
Tot. |
120 |
804 (85.98) |
83 (8.88) |
52 (5.56) |
935 |
2.2 不同活体采卵批次的采卵效果
本研究对20头摩拉和尼里-拉菲水牛分别连续采卵三次,共穿刺了935个可视卵泡,采卵结果如表2、表3所示。
表2 不同活体采卵批次的采卵效果
Table 2 Effect of OPU Replicate on Oocyte Recovery
组别
Treatment |
采卵头次
Replicates |
穿刺卵泡数
Follicles aspirated |
回收卵母细胞
Oocytes recovered |
可用卵母细胞
Oocytes used |
卵母细胞回收率%
Recovery rate |
第1次
1st OPU |
40 |
9.23±0.71 aA |
6.45±0.83 aA |
3.63±0.50 |
69.91 |
第2次
2nd OPU |
40 |
6.72±0.36 bB |
4.60±0.44 B |
3.72±0.35 |
68.40 |
第3次
3rd OPU |
40 |
7.43±0.50 b |
5.03±0.49 b |
4.05±0.43 |
67.68 |
合计
Tot. |
120 |
7.69±0.33 |
5.36±0.35 |
3.80±0.23 |
68.77 |
注(Note):A,B,P< 0.01;a,b,P <O.05
表3 不同活体采卵批次对水牛卵母细胞质量的影响
Table 3 Effect of OPU Replicate on Oocyte Quality
组别
Treament |
采卵头次
Replicates |
回收卵母细胞质量 Oocyte quality |
可用卵母细胞
Usable oocytes
(%) |
回收总数
Oocytes Recovered |
A级
Grade A
(%) |
B级
Grade B
(%) |
C级
Grade C
(%) |
D级
Grade D
(%) |
空透明带
Only Zona
(%) |
第1次
1st OPU |
40 |
39
(15.12) |
106
(41.09) |
61
(23.64) |
24
(9.30) |
28
(10.85) |
145
(56.20) A |
258 |
第2次
2nd OPU |
40 |
28
(15.22) |
121
(65.76) |
22
(11.95. |
8
(9.30) |
8
(10.85) |
149
(80.98) B |
184 |
第3次
3rd OPU |
40 |
18
(17.41) |
127
(63.18) |
22
(10.95) |
6
(2. 99) |
11
(5.47) |
162
(80.60) B |
201 |
合计
Tot. |
120 |
102
(15.86) |
354
(55.05) |
105
(16.33) |
38
(5.91) |
47
(7.31) |
456
(70.92) |
643 |
2.3 活体采集水牛卵母细胞的体外受精效果
活体采集的462个水牛卵母细胞,体外受精48h后分裂率为55.63%,第1次采卵回收的卵母细胞体外受精分裂率明显低于第2、3次,分别为46.67%、58.82%和62.50%;而各批次活体采集的卵母细胞经体外受精后囊胚率分别为18.79%、16.99和25.00%,差异不显著(P>0.05)。
表4 不同活采批次卵母细胞体外受精效果
Table 4 Effect of OPU Replicate on In-vitro Fertilization
组别
Group |
卵数
Oocytes |
分裂
Cleavages |
分裂率 %
Cleavage rate |
囊胚
Blastocysts |
囊胚率%
Blastocyst rate |
第1次
First OPU |
165 |
77 |
46.67 (77/165) aA |
31 |
(18.79) |
第2次
Second OPU |
153 |
90 |
58.82 (90/153) b |
26 |
(16.99) |
第3次
Third OPU |
144 |
90 |
62.50 (90/144) bB |
36 |
(25.00) |
合计
Tot. |
462 |
257 |
55.63 (257/462) |
93 |
(20.13) |
2.4 不同品种水牛活体采卵和体外受精比较
摩拉、尼里-拉菲水牛每头次可采卵泡数、头均回收卵母细胞数、头均可用卵母细胞和回收率均差异不显著(P>0.05),活体采集的摩拉水牛和尼里-拉菲水牛卵母细胞体外受精后囊胚率分别为21.25%和18.92%,差异也不显著(P>0.05)。详见表5和表6。
表5 不同品种水牛活体采卵效果
Table 5 Effect of Buffalo Breed on Oocyte Recovery
品种
Breed |
采卵头次
Replicates |
穿刺卵泡数
Follicles aspirated |
回收卵数
Oocytes recovered |
可用数
Oocytes
used |
卵母细胞回收率%
Recover rate |
摩拉
Murrah |
60 |
7.82±0.41 |
5.51±0.41 |
3.96±0.24 |
70.02 |
尼里-拉菲
Nili-Ravi |
60 |
7.60±0.52 |
5.20±0.30 |
3.63±0.31 |
67.41 |
表6 不同品种水牛活体采集卵母细胞体外受精效果
Table 6 Effect of Buffalo Breed on In-vitro Fertilization
品种
Breed |
卵数
Oocytes |
分裂
Cleavage |
分裂率
Cleavage rate |
囊胚
Blastocyst |
囊胚率
Blastocyst rate |
摩拉
Murrah |
240 |
137 |
57.08 (137/240) |
51 |
21.25 (51/240) |
尼里-拉菲
Nili-Ravi |
222 |
120 |
54.05 (120/222) |
42 |
18.92 (42/222) |
3.讨论
本研究发现,无论是摩拉或是尼里-拉菲水牛,卵巢的卵泡均以2~5mm直径卵泡为主,比例达85.98%。采卵前后小卵泡比例变化不大,但大卵泡比例有所下降,由采卵前的7.13%下降至第3次采卵前的3.6%,而中等直径卵泡则略有增加,由5.96%增加至11.78%。
活体采卵的优点在于可以长期反复在活体上采集卵母细胞。本次研究共连续进行了3次采卵试验,结果平均每头次穿刺卵泡为7.69±0.33个,明显高于Yadav 等 [5]报道经eCG处理的青年水牛和经产水牛,每头水牛卵巢上有5.12个可采卵泡,且也高于Boni等[6]用FSH-P处理卵巢发育障碍且长期不发情的6头水牛可获穿刺卵泡的数量(处理和未处理分别为6.75与4.1枚),但与先前的Promdireg A.等[7]用FSH激素处理沼泽型发情水牛5头和产后泌乳水牛6头所获的卵泡数(发情水牛和产后泌乳水牛分别为7.2±3.7和9.0±3.2枚)和黄右军等 [8]研究报道(7.94枚)的相似。
在连续进行采卵时发现,第1、2、3次采卵平均穿刺卵泡数和头均回收的卵母细胞数虽存在差异,但头均可用卵母细胞数并无差异。本研究平均每头次采卵可回收5.36±0.35枚卵母细胞,这与Techkumphu M等[9]利用9头初情前小母水牛经FSH超排处理后活采平均每头次可回收卵母细胞5.4±3.7枚和Promdireg A.等[7]研究的产后泌乳水牛获5.9±3.5枚相似,而Yadav等[5]报道仅为2.85±0.28枚卵母细胞,Boni等[10]为2.71±1.75枚,Gerber等[11]为2.5枚,Gali等[12]为4.1枚,Promdireg A.等[7]研究的沼泽型发情水牛为3.7枚。平均卵母细胞回收率为68.77%,第1、2、3次采卵回收率差异不显著。而一些作者报道的为43-55%[10,13,14],这可能是由于供体水牛品种、生理状态、营养状况和采卵者技术水平不一所致。
本次试验结果表明(见表3),活体采集水牛卵母细胞以A、B级卵母细胞为主,平均卵母细胞可用率达70.92%,与Yadav等[5]报道的经eCG处理的摩拉母水牛活体采卵回收率(71.60%),未经处理的摩拉水牛卵母细胞平均回收率(64.18%)相似(2006)。第1次采卵卵母细胞可用率仅为56.20%,第2、3次采卵可用率却上升至80.98%和80.60%,差异极显著(P<0.01)。这是由于第1次采卵时闭锁卵泡较多,随采卵次数增加,闭锁卵泡减少,卵母细胞质量提高,因而回收的可用卵母细胞比例也随之增加,但每次活采头均获可用卵母细胞数没有差异,第1、2、和3次分别为3.63±0.50、3.72±0.35和4.05±0.43。由此说明,间隔3d连续活体采集水牛卵母细胞是可行的。这结果与先前报道的相似[8]。值得注意的是,本次试验回收卵母细胞中平均裸卵率为16.33%,虽低于Yadav报道的39.9%,但仍有7.31%的空透明带,可能是采卵时所用的抽吸真空负压可能过大所造成。
本研究平均囊胚为20.13%, 略高于Boin等[10]活体采集意大利地中海奶水牛卵母细胞体外生产胚胎的囊胚率(为16.7%);而与Neglia G.等[15] 用8头干奶期的奶水牛进行活采体外生产的囊胚率 19.9±4.2%相似,但显著低于黄右军等[8]报道的活体采集卵母细胞体外受精的囊胚率(30.2%)和Kitiyanant等[16]应用6头经同期发情母水牛(3-5岁)活采后的体外受精囊胚率(26.7%)。这可能是由于本实验将每头供体的卵母细胞单独培养,绝大多数为1~6个/滴,每个液滴培养卵数太少所致。
研究发现,利用摩拉、尼里-拉菲水牛进行活体采集卵母细胞,虽然每头次可采卵泡数、头均回收卵母细胞数、头均可用卵母细胞和回收率以及其体外受精效果差异不显著,但不同个体卵泡再生的差异较大,个体间每次采卵回收的卵母细胞数变异仍较大(为0-15枚不等)。由此说明,为了提高活体采卵的效果,加强供体牛的个体选择是十分重要的。Gasparini等[4]之前的报道也证实这个观点。
参考文献
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Ovum Pick-Up and In-vitro Embryo Production in Water Buffalo
LIANG xian-wei,ZHANG xiu-fang, YANG bing-zhuang, CHEN ming-tang, HUANG fen-xiang,
PANG chun-ying, LIAO chao-hui, QIN guang-sheng, WEI sheng-ju, HUANG you-jun
(Guangxi Buffalo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530001, P. R of China )
Abstract: Transvaginal ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) was performed on 40 Nili-Ravi and Murrah buffaloes for consecutive 3 times each, at an interval of 3 days. A total of 935 follicles were aspirated, 643 oocytes were retrieved, while 456 oocytes of them were usable. The recovery rate was 68.77%(643/935), and the percentage of usable oocytes was 70.92%(456/643), an average of 3.80±0.23 oocytes were usable for per buffalo. The number of usable oocytes for the first, second and third OPU was 3.82±0.50,3.82±0.35,4.05±0.43, respectively, the difference among them was not significant(P<0.05). After in-vitro maturation (IVM), in-vitro fertilization (IVF) and co-incubation with single layer of granular cells, the cleavage rate was 56.36%(257/456), blastocyst formation rate was 20.39%(93/456). There’s no significant difference between the two breeds on aspirated follicles, recovery rate of oocytes and blastocyst formation rate of per buffalo. The results proved the feasibility of in-vitro embryo production of oocytes obtained by transvaginal ultrasound-guided consecutive OPU.
Keywords:Water buffalo, Transvaginal ultrasound-guided aspiration, Ovum pick-up (OPU), In-vitro fertilization (IVF)