梁贤威 张秀芳 杨炳壮 陈明棠 黄芬香 庞春英 廖朝辉 覃广胜 韦升菊 黄右军

（中国农科院广西水牛研究所，广西南宁530001）

 

摘要  本研究应用B超引导阴道穿刺法，对40头尼里-拉菲和摩拉水牛连续3次采卵，采卵间隔为3天，共采卵120头次。共穿刺卵泡935个，采集卵母细胞643枚，可用卵母细胞为456枚，卵母细胞回收率为68.77%（643/935），卵母细胞可用率为70.92%（456/643）头均可用卵母细胞为3.80±0.23个。第1、2、3次采卵头均回收可用卵母细胞数分别为3.82±0.50，3.82±0.35，4.05±0.43枚，差异不显著（P<0.05）。收集的卵母细胞经体外成熟、体外受精和受精卵与颗粒细胞单层体外共培养，受精后48h分裂率为56.36%（257/456），囊胚率为20.39%（93/456）。两个品种水牛在头均可采卵泡、头均回收卵母细胞和囊胚率均无显著差异。结果表明，在B超引导下进行连续活体采卵，并利用卵母细胞进行体外受精生产胚胎是可行的。

   关键词： 水牛， B超引导阴道穿刺， 活体采卵，  体外受精

 

1988年，Pieterse等^[1]发明了B型超声波引导活体采卵法，经子宫壁采集牛卵母细胞，经过十几年的发展，在牛上获得了较为广泛的应用。水牛由于其繁殖生理的特殊性，致使超数排卵及其胚胎回收效果较差，且水牛个体对激素反应差异很大，限制了超数排卵的应用^[2＿3]。而活体采卵可重复从遗传价值高的水牛采集卵母细胞，其与体外受精技术相结合可生产大量系谱明确的胚胎。与传统的超数排卵-胚胎回收相比，水牛活体采卵-体外胚胎生产技术具有许多优点，可克服母畜生殖道疾病对胚胎质量的影响，每头供体每月可生产更多的可移植胚胎（2.0vs0.6） ^[4]。活体采卵与体外受精和胚胎移植相结合，可充分利用优良母畜的遗传潜力，缩短家畜世代间隔，从而加速水牛的遗传改良进程。本研究旨在应用活体采卵结合体外受精技术，生产出系谱明确的良种水牛胚胎，以探讨加快良种水牛扩繁的新途径。

1 材料与方法

1.1 供试牛

40头健康、繁殖机能正常的空怀摩拉和尼里-拉菲母水牛，年龄5~12岁，体重580~720 kg，体况良好，饲养在半封闭式牛舍。将供体牛随机分为4组，每组10头。

1.2 试验用品

本研究所用试剂均为Sigma公司产品。采卵液为改良磷酸缓冲液(DPBS)，添加100µg/ml青霉素、60µg/ml链霉素、6µg/ml肝素钠和3%新生牛血清(NBS)。活体采卵仪为日本Honda公司生产的HS2000B型超声波显像仪，阴道扇形扫描探头（Aloka），60 cm长采卵针，真空泵和恒温槽以及胚胎过滤杯等。

体外受精液为改良Tyrode’S+60µg/ml肝素钠；受精卵培养液为TCM199+10%新生牛血清(NBS)。卵母细胞受精24h后转入颗粒细胞单层培养，每2d换液1次，直到培养结束。IVM、IVF和IVC均在39℃、5%CO₂、饱和湿度的条件下进行。

1.3 卵母细胞的采集

对供体水牛进行保定，清除直肠粪便，清洗并清毒外阴后，将B超探头套上避孕套，在探头前端涂抹润滑剂。操作者左手经直肠把握固定卵巢，右手将安装有采卵针的探头缓慢插入阴道穹隆处采卵一侧，并将卵巢牵引紧贴在探头前端，这时从B超显示器上可显示出卵巢图像和卵泡位置、大小，前后左右翻转卵巢，记录卵泡数，调节真空泵压力为40~60 mm汞柱，推动采卵针穿刺卵泡，同时用脚踏开关启动真空泵进行采卵，采完一头供体后，迅速将回收液送回实验室收集卵母细胞。

1.4 卵母细胞体外成熟

将回收液倒入胚胎过滤杯，用含3%NBS的DPBS清洗2-3次，在体视镜下收集卵母细胞，将收集的卵母细胞分级，完整包被二层以上卵丘细胞且细胞质均匀的卵母细胞为A级；附着一层卵丘细胞且细胞质均匀的为B级；裸卵和虽附着卵丘细胞但细胞质不均匀的为C级，D级为卵丘细胞扩散的卵母细胞。A、B级用于体外成熟培养，C、D级则弃去不用。卵母细胞在含5%NBS和20mMHepes的TCM199液中洗2次，再用体外成熟液洗1次，转入50uL/滴的培养液中培养，每头供体的卵母细胞单独培养，体外成熟液为TCM199+10%胎牛血清+50µM半胱胺+10µg/ml FSH+12 U/mI LH+1µg/ml E₂，卵母细胞在39℃、5 %CO₂，最大相对湿度的培养箱中成熟22~24 h。

1.5 体外受精

实验用摩拉和尼里-拉菲水牛细管冻精均购自广西壮族自治区畜禽品种改良站。精子处理液采用含0.3%BSA的Sperm-TALP，受精液采用含0.6%BSA+60µg/ml肝素钠的Fert-TALP。解冻后将精液悬浮于3ml预热的洗精液中上游1h以分离活精子，2000rpm/5min离心收集上清液，活精子沉淀后再用3ml受精液离心洗一次。

体外成熟22~24h的卵母细胞，经精子处理液洗2次，受精液洗1次后，转移到覆盖石蜡油的30µL/滴的受精液滴中，加入经上浮法处理的精子，调节最终精子浓度为2×10⁶个/mL，培养条件同体外成熟，精子和卵子共同孵育22~24 h。

1.6 早期胚胎的体外培养

受精后的卵母细胞用含5%NBS的Hepes-TCM199洗2~3次，吸管反复吹打去除卵丘细胞后，再用含10%NBS的TCM199液洗1次，转入颗粒细胞单层液滴，放入39℃、5 %CO2，饱和湿度的CO₂培养箱中培养。培养液每2d换半液，受精48h后检查受精卵分裂率，第5~10天观察囊胚发育情况。

1.7 数据统计分析

所得数据平均数采用T检验进行比较，方差分析进行多重比较，百分数则采用卡方检验。

2 结果与分析

2.1 活体采卵前后水牛卵巢卵泡发育的变化

通过B超观察了40头摩拉、尼里-拉菲水牛在活体采卵前后卵泡发育情况，结果如表1所示，试验共观察了卵泡935个，发现水牛卵巢的卵泡仍以2~5mm直径的小卵泡为主，小卵泡、中卵泡和大卵泡比例分别为85.98%、8.88%和5.56%。

表1 采卵前后水牛卵巢卵泡发育的变化

Table 1 Effect of OPU Replicate on Follicle Recruitment

组别 Treament	观察头数 Replicates	小卵泡 Small follicles (2-5mm)	中卵泡 Medium follicle (5-10mm)	大卵泡 Large follicle (>10mm)	合计 Tot.
第1次 1st  OPU	40	319 (86.44)	20 (5.96)	30 (7.13)	369
第2次 2nd OPU	40	232 (86.24)	26 (9.67)	11 (4.09)	269
第3次 3rd OPU	40	253 (85.19)	35 (11.78)	10 (3.6)	297
合计 Tot.	120	804 (85.98)	83 (8.88)	52 (5.56)	935

2.2 不同活体采卵批次的采卵效果

本研究对20头摩拉和尼里-拉菲水牛分别连续采卵三次，共穿刺了935个可视卵泡，采卵结果如表2、表3所示。

表2 不同活体采卵批次的采卵效果

Table 2 Effect of OPU Replicate on Oocyte Recovery

注(Note)：A，B，P< 0．01；a，b，P <O．05

 

表3 不同活体采卵批次对水牛卵母细胞质量的影响

     Table 3 Effect of OPU Replicate on Oocyte Quality

2.3 活体采集水牛卵母细胞的体外受精效果

活体采集的462个水牛卵母细胞，体外受精48h后分裂率为55.63%，第1次采卵回收的卵母细胞体外受精分裂率明显低于第2、3次，分别为46.67%、58.82%和62.50%；而各批次活体采集的卵母细胞经体外受精后囊胚率分别为18.79%、16.99和25.00%，差异不显著（P＞0.05）。

表4  不同活采批次卵母细胞体外受精效果

Table 4 Effect of OPU Replicate on In-vitro Fertilization

组别 Group	卵数 Oocytes	分裂 Cleavages	分裂率 % Cleavage rate	囊胚 Blastocysts	囊胚率% Blastocyst rate
第1次 First OPU	165	77	46.67 (77/165) aA	31	(18.79)
第2次 Second OPU	153	90	58.82 (90/153) b	26	(16.99)
第3次 Third OPU	144	90	62.50 (90/144) bB	36	(25.00)
合计 Tot.	462	257	55.63 (257/462)	93	(20.13)

2.4 不同品种水牛活体采卵和体外受精比较

摩拉、尼里-拉菲水牛每头次可采卵泡数、头均回收卵母细胞数、头均可用卵母细胞和回收率均差异不显著（P>0.05），活体采集的摩拉水牛和尼里-拉菲水牛卵母细胞体外受精后囊胚率分别为21.25%和18.92%，差异也不显著（P>0.05）。详见表5和表6。

表5  不同品种水牛活体采卵效果

Table 5 Effect of Buffalo Breed on Oocyte Recovery

 

表6 不同品种水牛活体采集卵母细胞体外受精效果

Table 6 Effect of Buffalo Breed on In-vitro Fertilization

品种 Breed	卵数 Oocytes	分裂 Cleavage	分裂率 Cleavage rate	囊胚 Blastocyst	囊胚率 Blastocyst rate
摩拉 Murrah	240	137	57.08 (137/240)	51	21.25 (51/240)
尼里-拉菲 Nili-Ravi	222	120	54.05 (120/222)	42	18.92 (42/222)

 

3.讨论

本研究发现，无论是摩拉或是尼里-拉菲水牛，卵巢的卵泡均以2~5mm直径卵泡为主，比例达85.98%。采卵前后小卵泡比例变化不大，但大卵泡比例有所下降，由采卵前的7.13%下降至第3次采卵前的3.6%，而中等直径卵泡则略有增加，由5.96%增加至11.78%。

活体采卵的优点在于可以长期反复在活体上采集卵母细胞。本次研究共连续进行了3次采卵试验，结果平均每头次穿刺卵泡为7.69±0.33个，明显高于Yadav 等 ^[5]报道经eCG处理的青年水牛和经产水牛，每头水牛卵巢上有5.12个可采卵泡，且也高于Boni等^[6]用FSH-P处理卵巢发育障碍且长期不发情的6头水牛可获穿刺卵泡的数量(处理和未处理分别为6.75与4.1枚)，但与先前的Promdireg A.等^[7]用FSH激素处理沼泽型发情水牛5头和产后泌乳水牛6头所获的卵泡数（发情水牛和产后泌乳水牛分别为7.2±3.7和9.0±3.2枚）和黄右军等 ^[8]研究报道（7.94枚）的相似。

在连续进行采卵时发现，第1、2、3次采卵平均穿刺卵泡数和头均回收的卵母细胞数虽存在差异，但头均可用卵母细胞数并无差异。本研究平均每头次采卵可回收5.36±0.35枚卵母细胞，这与Techkumphu M等^[9]利用9头初情前小母水牛经FSH超排处理后活采平均每头次可回收卵母细胞5.4±3.7枚和Promdireg A.等^[7]研究的产后泌乳水牛获5.9±3.5枚相似，而Yadav等^[5]报道仅为2.85±0.28枚卵母细胞，Boni等^[10]为2.71±1.75枚，Gerber等^[11]为2.5枚，Gali等^[12]为4.1枚，Promdireg A.等^[7]研究的沼泽型发情水牛为3.7枚。平均卵母细胞回收率为68.77%，第1、2、3次采卵回收率差异不显著。而一些作者报道的为43-55%^{[10，13，14]}，这可能是由于供体水牛品种、生理状态、营养状况和采卵者技术水平不一所致。

本次试验结果表明（见表3），活体采集水牛卵母细胞以A、B级卵母细胞为主，平均卵母细胞可用率达70.92%，与Yadav等^[5]报道的经eCG处理的摩拉母水牛活体采卵回收率(71.60%)，未经处理的摩拉水牛卵母细胞平均回收率(64.18%)相似（2006）。第1次采卵卵母细胞可用率仅为56.20%，第2、3次采卵可用率却上升至80.98%和80.60%，差异极显著（P<0.01）。这是由于第1次采卵时闭锁卵泡较多，随采卵次数增加，闭锁卵泡减少，卵母细胞质量提高，因而回收的可用卵母细胞比例也随之增加，但每次活采头均获可用卵母细胞数没有差异，第1、2、和3次分别为3.63±0.50、3.72±0.35和4.05±0.43。由此说明，间隔3d连续活体采集水牛卵母细胞是可行的。这结果与先前报道的相似^[8]。值得注意的是，本次试验回收卵母细胞中平均裸卵率为16.33%，虽低于Yadav报道的39.9%，但仍有7.31%的空透明带，可能是采卵时所用的抽吸真空负压可能过大所造成。

本研究平均囊胚为20.13%， 略高于Boin等^[10]活体采集意大利地中海奶水牛卵母细胞体外生产胚胎的囊胚率（为16.7%）；而与Neglia G.等^[15] 用8头干奶期的奶水牛进行活采体外生产的囊胚率 19.9±4.2%相似，但显著低于黄右军等^[8]报道的活体采集卵母细胞体外受精的囊胚率（30.2%）和Kitiyanant等^[16]应用6头经同期发情母水牛(3-5岁)活采后的体外受精囊胚率(26.7%)。这可能是由于本实验将每头供体的卵母细胞单独培养，绝大多数为1~6个/滴，每个液滴培养卵数太少所致。

研究发现，利用摩拉、尼里-拉菲水牛进行活体采集卵母细胞，虽然每头次可采卵泡数、头均回收卵母细胞数、头均可用卵母细胞和回收率以及其体外受精效果差异不显著，但不同个体卵泡再生的差异较大，个体间每次采卵回收的卵母细胞数变异仍较大（为0-15枚不等）。由此说明，为了提高活体采卵的效果，加强供体牛的个体选择是十分重要的。Gasparini等^[4]之前的报道也证实这个观点。

 

参考文献

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Ovum Pick-Up and In-vitro Embryo Production in Water Buffalo

LIANG xian-wei,ZHANG xiu-fang, YANG bing-zhuang, CHEN ming-tang, HUANG fen-xiang,

PANG chun-ying, LIAO chao-hui, QIN guang-sheng, WEI sheng-ju, HUANG you-jun

(Guangxi Buffalo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530001, P. R of China   )

 

Abstract: Transvaginal ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) was performed on 40 Nili-Ravi and Murrah buffaloes for consecutive 3 times each, at an interval of 3 days. A total of 935 follicles were aspirated, 643 oocytes were retrieved, while 456 oocytes of them were usable. The recovery rate was 68.77%（643/935）, and the percentage of usable oocytes was 70.92%（456/643）, an average of 3.80±0.23 oocytes were usable for per buffalo. The number of usable oocytes for the first, second and third OPU was 3.82±0.50，3.82±0.35，4.05±0.43, respectively, the difference among them was not significant（P<0.05）. After in-vitro maturation (IVM), in-vitro fertilization (IVF) and co-incubation with single layer of granular cells, the cleavage rate was 56.36%（257/456）, blastocyst formation rate was 20.39%（93/456）. There’s no significant difference between the two breeds on aspirated follicles, recovery rate of oocytes and blastocyst formation rate of per buffalo. The results proved the feasibility of in-vitro embryo production of oocytes obtained by transvaginal ultrasound-guided consecutive OPU.

Keywords：Water buffalo, Transvaginal ultrasound-guided aspiration, Ovum pick-up (OPU), In-vitro fertilization (IVF)